一、前言

　　牛流行熱（bovine ephemeral fever）又稱暫時熱，病原為桿狀病毒科（rhabdoviridae）的牛流行熱病毒（BEFV），經由蚊子、庫蠓等昆蟲媒介傳染，引起牛病毒性疾病，流行地區包括非洲、亞洲、中東及大洋洲等地。主要症狀包括雙波或多波發熱、顫抖、食慾不佳、眼或鼻分泌物、流涎、呼吸困難、瘤胃鼓脹、抑鬱、跛足、四肢僵硬及產乳量突然降低等。亞熱帶地區發生季節約為夏天至早秋，通常6個月至2歲齡牛隻最易受感染而發病，本病在台灣疫情最早於3月份發生，最晚於10月，流行期可含括8個月。牛流行熱病毒的基因體為負股的單股RNA，具有5個結構性蛋白包括核蛋白 (N)、聚合酶相關蛋白 (P)、基質蛋白 (M)、大核醣核酸酶(L) 和表面醣蛋白 (G)。 G醣蛋白分子量約81kDa為第一型的膜醣蛋白，包含型別特異性和中和性抗原決定位，能激發牛隻產生保護性免疫。以中和性單株抗體 (MAbs) 和抗中和性的單株抗體突變株，兩者以交叉競爭性結合試驗，結果可證實G醣蛋白上有4個完整的中和抗原決定位分別為G1、G2、G3和G4。根據1992年Cybinski比對分析許多澳洲分離株和大陸分離株，發現某些分離株在抗原性的部份有一些改變但不影響其抗原性，證實目前全世界牛流行熱僅有一種血清型。

二、診斷方法

　　本病的診斷方法通常以發熱前期或初期的抗凝血液或疑罹病動物臟器，以反轉錄聚合酶鏈反應試驗初步鑑定，同時以細胞株盲目繼代分離病毒或以哺乳小鼠腦內接種分離等病原檢測，另配對血清以檢測抗體是否陽轉來判定。

　　(一)株化細胞分離病毒與鑑定

　　病材應採發病牛隻的抗凝血液約10mL(可添加肝素採集脫纖血)，以冷藏方式運送到實驗室後，血液先經離心5分離出血球及血漿層，分別收集血漿後，血球部份加入無菌的磷酸緩衝食鹽溶液(PBS)。以搖晃混合後再經離心方式將上層的 PBS溶液去除，再以 PBS 溶液清洗血球液後分裝再置入 -80 ℃冷凍保存供病毒分離。病牛剖檢後採集其肺、氣管、脾等各臟器以細胞培養液，製成10％（W/V）乳劑，經低溫離心後取上清液保存，供病毒分離用。BHK-21、Vero等株化細胞增殖成單層細胞後，接種上述的病材病材並感作，再加入細胞培養，置入34℃恆溫箱中培養。第1代培養往往無病毒增殖現象，須經過2至3次繼代才會顯現。當病毒增殖形成細胞病變 (CPE)，可取病毒液進行電子顯微鏡檢查病毒顆粒或RT-PCR試驗，或是以牛流行熱免疫血清作病毒鑑定。

　　(二)小老鼠分離病毒與同定

　　上述的病材接種出生1日齡小老鼠的大腦內，接種的老鼠若死亡或呈現神經症狀，可取出腦製成乳劑，取上清液進行電子顯微鏡檢查有無病毒顆粒或RT-PCR反應，或再利用株化細胞進行病毒大量增殖。

　　 (三)血清學診斷

　　牛流行熱血清學診斷方法以血清中和抗體力價測定比較配對血清力價，第1次採集急性發熱期病牛血清，經過10至15天再採集同一隻病牛血清，進行中和試驗，以感染前後期中和抗體力價陽轉4倍或以上，以判定為感染牛流行熱。

　　 (四)反轉錄聚合酶鏈反應 (reverse transcriptase polymerase chain reaction； RT-PCR)和巢式聚合酶鏈反應（Nested PCR）檢測法

　　針對牛流行熱之G醣蛋白基因，設計一對引子，以增幅出檢體中牛流行熱病毒核酸特異片段，因為以偵測病毒核酸為主，當病毒已被不活化而無法分離時，此法亦可適用。試驗過程約3小時，比株化細胞分離病毒診斷法快速且敏感性高，適合實驗室快速診斷之用。另外，在引子序列內側再設計另一組引子（稱為巢式引子），取R-PCR產物為模板，再加入巢式引子進行第2次PCR反應，可大幅提升檢測病毒核酸的敏感性。以巢式引子替代原先引子，若PCR產物大小可判定是否為陽性。分子量大小符合的RT-PCR和PCR產物可再以自動定序儀進行定序反應，並將解讀的核苷酸序列以NCBI Blast軟體至GenBank擷取序列來比對以再次確認檢驗結果。

　　(五)即時定量RT-PCR（real-time quantitative RT-PCR）

　　即時定量RT-PCR是一種改良自傳統RT-PCR 的新技術，利用帶有螢光的探針或是可與DNA 結合的螢光染劑（例如SYBR green I）在PCR 的增幅過程中不斷地嵌入產物當中，並以電腦即時地偵測螢光訊號的強度來反映PCR 產物累積的程度，繼而分析螢光強度與PCR 循環數的關係，再與已知量的標準RNA相比較，將模板中所含的RNA進行定性與定量分析。當產物Cp 值介於14.08至27.22之間，Tm 曲線的頂點溫度約在76.19~77.27℃可判定為牛流行熱陽性。

三、牛流行熱G醣蛋白基因序列分析

　　G醣蛋白與中和性抗原決定位有關，故分析此序列可以了解其抗原性的演變及親緣關係。解讀序列之牛流行熱病毒株包括2007年分離株H80、H82、H85、H90、H91等5株，2004年分離株CH1、CH2、KS及ML等4株，2002年HL株，2001年YL株，1996年TC株，其餘之病毒株1999年TN株與1984年VAC疫苗株和BB7721澳洲株擷取自GenBank，經DNAstar軟體分析其親緣關係，顯示亞洲株與澳洲株為不同的2個基因群；亞洲株群可區分台灣株與日本株2個基因群。台灣株又可分成疫苗群和野外病毒群 (圖1DOCX / pdf / odt)。2007年5株分離株與VAC-1984疫苗株胺基酸序列相似性為96.3％至96.7％，與1999年TN株胺基酸序列相似性為97.5％至98.6％。比較疫苗株與12株1996年至2007年野外毒株G醣蛋白抗原區氨基酸的序列，並無氨基酸漂移 (shift) 和轉變 (drift )，僅發現點突變現象，故應該不會影響其抗原性。VAC-1984疫苗株與2007株之間核酸序列差異為3.7％，RNA病毒每年的2％核酸差異度及每10年5％核酸差異度為合理的演化速率，估量台灣1984年至2007年的牛流行熱病毒應該是同一病毒株演化的結果。2001年至2007年所分離的牛流行熱病毒分別與疫苗株進行交叉中和試驗，證實其中和性抗原並未改變，仍可被國產牛流行熱不活化疫苗免疫之血清中和，故市售疫苗仍具保護力。

四、牛流行熱抗體監測

　　由於牛群中牛流行熱抗體分布表現與疫情的發生具關聯性，為提供牛流行熱疫情的預警，自2000年起至今，每年分別於4月及10月，針對台灣16個縣 (市) 的乳牛逢機採樣血清約4,000支，依疫苗免疫後血清抗體消長的情形為評估指標，2001~2008年各年度4月及10月抗體力價幾何平均值詳如表1 DOCX / pdf / odt。根據前人研究，血清中和抗體力價大於或等於32倍時，可保護牛隻不被野外病毒感染，故以32倍為一分界點，將牛隻以力價分類，結果亦參考表1。2001年、2004年、2005年、2006年和2007年，4月份中和抗體力價平均值皆低於32倍而且小於32倍的牛群比例都高於30%，評估抗體力價消長的速度，如果7月份不完成第2劑疫苗補強，推斷至秋季牛流行熱流行期，抗體力價更低感染病毒風險更高，故2001年、2004年和2007年於颱風過後病媒蚊滋生，於台灣中、南部爆發流行。

　　2008年4月份的抗體調查發現，血清中和抗體力價平均值為47.72倍，各縣市抗體力價幾何平均值詳如表2 DOCX / pdf / odt。其中台北縣、桃園縣、苗栗縣、彰化縣、屏東縣抗體力價皆低於32倍，小於32倍的牛群比例都高於30％，群體免疫效力未臻理想，當適合蟲媒生長之環境因子出現，畜主不加強疫苗免疫，即難以遏止疾病發生。

五、結論

　　牛流行熱分別於1967、1984、1989、1996、1999、2001、2004與2007年發生較大的流行，造成養牛戶相當的經濟損失。惟自1984年台灣牛隻起使用不活化疫苗免疫政策防範本病發生措施後，故於1999年以後本病流行態樣從週期性大流行轉變成小規模多處或單處散發疫情，但是間歇期漸漸縮短為2至3年一次。本病必須藉由病媒蚊傳播，發生的疫區或季節皆具有溫暖與潮濕等相似的氣候條件。台灣位處亞熱帶，全年溫熱潮溼、雨量豐沛的季節相當地長，病媒蚊數量隨著氣候與環境因子起伏，難以掌控。故現行的防疫措施首先建立養牛戶的自衛防疫共識，除建議養牛戶須加強飼養管理與環境條件的改善，並配合每週三全國環境消毒日降低病媒蚊指數，且更須依政府防疫機關建議於每年1月及6或7月前落實完成牛隻牛流行熱疫苗2次預防注射，以提升牛群整體抗體力價達保護的水準，防疫機關並應於4月底及10月底採取轄內牛隻血清，以測定抗體消長情形，冀以抗體調查來監控疫情，預防疾病的發生。