93年10月（第148期）
組織培養瓶內苗細菌的防除
一、前言
組織培養技術已普遍應用於園藝作物的大量繁殖，其中生產健康種苗成為商業生產之主要目的，早期對健康種苗的認定是指未感染影響植株生育的病毒病，近年來，除了病毒以外，種苗是否攜帶細菌性或真菌性病原亦受到重視。組織培養過程中攜帶細菌性病原，於培養初期並無法以肉眼篩檢，需經長期繼代培養才會表現病徵，甚至在組培苗移植後才出現病徵，因此常造成量產上巨大損失。Cassels 等人指出許多組織培養實驗室受到細菌「爆發性」污染致使整批作物損失。Leifert 等人估算組織培養苗因為細菌污染造成20~55％的經濟損失。
二、感染組培瓶內苗細菌的種類
Stead 認為細菌感染組培苗包括三方面：（一）.具病原性的細菌感染瓶內苗及成株，（二）具病原性的細菌僅感染瓶內苗，（三）非病原性的細菌污染瓶內苗（俗稱發霉）。針對此問題設計實驗調查本場生產的彩色海芋、馬鈴薯組培瓶內苗可能潛藏哪一類細菌。
首先測試具病原性的彩色海芋軟腐菌是否經由組織培養過程傳播至組織培養瓶內苗及成株，在瓶內苗接種彩色海芋軟腐菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora），濃度分別為108cfu/ml、107cfu/ml、106cfu/ml，105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、101cfu/ml，接種的菌量有20ul、50ul、100ul三種方式，共計24種處理；在25℃，每日照光16小時、黑暗8小時的環境中，一星期內，各處理的軟腐菌侵入組織培養瓶內的彩色海芋植株，迅速蔓延造成瓶內苗整株軟腐；另以人工接種法將軟腐菌接種到彩色海芋組織培養之母瓶、增殖瓶、發根瓶的培養基內，結果軟腐菌均能在這些培養基上生長、繁殖，顯示彩色海芋軟腐菌無法潛伏感染彩色海芋組織培養瓶內苗，一旦感染，經過一星期便可使用肉眼判斷出來。
以人工接種法將馬鈴薯青枯病菌（Ralstonia solanacearum）接種至馬鈴薯組培苗之培養基內，結果培養母瓶、增殖瓶、發根瓶的培養基均適合青枯病菌生長、繁殖，顯示一旦青枯病菌進入馬鈴薯組培苗之各階段生產瓶內，48小時會繁衍至肉眼可察。
此外，陸續收集、分離彩色海芋組培瓶內苗的污染細菌，再利用菸草過敏性反應法鑑別細菌的致病力，截至目前為止發現都是非病原性的細菌。使用自動菌種鑑定系統（MicroStation system）鑑定菌株，已鑑定出一常見的瓶內苗污染細菌為Pasteurella volantium。
三、檢測組培瓶內苗細菌的方法
面對細菌污染或感染的問題，唯有適當的檢驗方法才能解決， Elphinstone 等人報告檢驗組培苗感染細菌的方法有三：（一）.選擇性培養基分離法（Selection Media），（二）.血清學的方法例如酵素連結抗體免疫分析法（ELISA），（三）.聚合酶連鎖反應法（PCR）。Stead 等人指出細菌之專一性抗體製備不容易，ELISA常出現偽反應，靈敏度不高，故用ELISA法檢測細菌較困難。至於PCR法需依賴貴重儀器設備、電腦軟體，僅適合特殊診斷。
本場試驗結果顯示（一）.利用TZC選擇性培養基偵測豐克、克尼伯、卡地娜等品種的馬鈴薯組織培養之增殖瓶瓶苗，並未發現感染馬鈴薯青枯病菌的植株，全是健康株。（二）.利用選擇性培養基TZC檢查草莓組織培養母瓶的瓶內苗，並未發現感染草莓青枯病菌的植株。（三）.溫室中種植草莓組培移植苗，經過2個月，草莓植株外觀無青枯病的病徵出現，故採取根、莖、葉、走莖等剪成１公分一小段，排放在TZC平板培養基上，培養48~72小時，結果培養基上植株片段兩端未出現粉紅色流體狀的青枯病菌，僅部分產生深紅色非病原性的菌株。
四、防治組培瓶內苗細菌的方法
組織培養之污染細菌常會造成培植體死亡、生長勢降低、黃化，尤其是後續培養形態發展潛力的改變，例如降低增殖倍率及發根率(George,1993)等，影響甚鉅。有關污染細菌的去除多集中在培養基內添加抗生素(Carew and Patterson, 1970)，但抗生素不耐高溫，易造成殺菌效果降低，除價格高外，增加成本，藥品管制不易購得，且大部分僅能抑制細菌的生長，而無法達到完全殺菌，高濃度的抗生素亦會抑制瓶苗芽體的生長，故尋求其它化學藥劑為有效解決方法之一。
利用不同濃度sorbic acid(0, 0.5, 1, 2, 4g/l)添加於培養基中去除組織培養彩色海芋(cv. Pacific Pink and Neroli)瓶苗中的污染細菌(Pasteurella volantium)，經培養20天後，發現二品種在高濃度下均造成叢生芽體死亡，低濃度下僅有5-20芽成活，此二品種在5處理間均發現菌斑，故品種與處理間均無差異（表1 DOCX / odt / pdf）。
組織培養的培養基在高溫高壓滅菌鍋是否完全殺菌是很重要的問題，傳統利用靜置法(約2星期)觀察，缺點是耗時長，目前使用高溫殺菌指示劑(sterilizer control tubes)可在滅菌後由顏色從紅轉褐到綠判別之，如果殺菌完全，則管內液體立刻轉成綠色。
五、結論
初期潛伏在組織培養瓶內苗污染或感染的細菌很難發現，等到肉眼可見時往往已造成嚴重損失。Leifert 報告最普遍檢測組織培養瓶內苗細菌的方法是抽取組織培養瓶內苗放在特定的〝指示培養基〞（例如：523培養基、George and Falkingham，s mycobacterium detection medium TT、Leifert and Waites Sterility Test Medium 等）內加以偵測。本場利用TZC選擇性培養基管控馬鈴薯、草莓組織培養增殖過程不受到青枯病菌威脅。然而指示培養基或選擇性培養基僅能檢測特定對象的細菌，無法利用一種培養基偵測所有重要的細菌。並且商品化檢測細菌的抗血清試劑亦僅能偵測一種細菌，價格昂貴不具經濟效益，尚無法應用在大量生產組培苗的品質管制流程。
為有效防止細菌在組培瓶內生長、繁殖的初次感染源是培養基殺菌完全，本場利用高溫殺菌指示劑於高溫高壓滅菌前與滅菌後的顏色變化作為培養基殺菌確效的指標，阻斷細菌在組培瓶內最初感染途徑，至於後續培養過程造成的污染或感染目前尚在找尋最佳的防治方法中。
參考文獻
- 陳駿季、沈再木 1997 參加「組織培養品質控制管理」國際研討會報告p17。
- Carew, D. P., and Patterson, B. D. 1970. The effect of antibiotics on the rrowth of C. roseus tissue culture. Lloydia 3:275-277.
- Cassels, A.C., Harmey,M.A., Carney,B.F., McCarthy,E., & McHigh ,A. 1988. Acta Hortic 225：153-161.
- Elphinstone,J.G., Stanford,H., and Stead, D.E. 1998. Dection of Ralstonia solanacearum in potato tubers Solanum dulcamara and associated irrigation water. In Bacterial Wilt Disease Molecular and Ecological Aspects Prior P Allen C and Elphinstone J G eds Springer Verlag Berlin/Heidelberg pp133-139.
- George,E.F. 1993. Plantpropagation by tissue culture. Part 1. The technology. Exegetics Ltd, Edington, Wilts. BA 13. 4QG, England.
- Leifert,C., Morris,C.E ., & Waites ,W.M. 1994. In vitro Crit Revs Plant Sci 13：139-183.
- Leifert,C.,andWoodward ,S. 1998. Laboratory contamination management：the requirement for microbiological quality assurance. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 52：83-88.
- Stead,D.E.,Hennessy,J.,Smith,N.,Weller,S.,and Elphinstone,J.G.1999 .
Detection and diagnosis of bacterial contaminants and pathogens in micropropagated plants. Abstracts of the ISHS Conference Methods and Markers for Quality Assurance in Micropropagation. p10.
- Stead,D.E., Elphinstone, J.G., Weller, S., Smith, N., and Hennessy, J. 2000. Modern methods for characterizing, identifying and detecting bacteria associated with plants.